3.3.2 Cultivo de meristemos apicales

Las pruebas para cultivar ápices y meristemos aislados de diferentes angiospermas datan del siglo pasado. En 1893 Rechinger intentó crecer en arena, con y sin nutrientes adheridos, yemas aisladas de Populus nigra y Fraxinus ornus se observó formación de callos básales y una ligera expansión de las partes superficiales, aunque no hubo desarrollo del sistema radicular (citado por Sahbdé y Murashige, 1977).

Yemas aisladas de Ceratopteris thalictroides (Brougn, 1908) crecieron en turba, produciendo hojas que fueron más pequeñas y morfológicamente más simples que las de las plantas progenitoras (citado por Sahbdé y Murashige, 1977).

Posteriormente, Robbins (1922ª) hizo los primeros intentos para cultivar ápices aislados en un medio artificial (in vitro). Ápices de col de 1 cm de diámetro (Brassica oleracea, var capitata), maíz (Zea mays) y algodón (Gossypium herbaceum) mostraron un desarrollo limitado cuando crecieron en un medio que contenía sales inorgánicas y glucosa; solo hubo respuesta en los ápices de col y maíz en condiciones de oscuridad (se observó desarrollo de hojas cloróticas y algunas raíces).

Withe (1933) obtuvo resultados positivos al cultivar ápices aislados de Sellaría media en gotas colgantes, en donde los ápices sobrevivieron algunas semanas. Hubo formación de pequeños primordios y no se observó diferenciación completa.

Ball (1946) realizó un  con ápices de Tropaeolum majus L. y Lupinus albus L., dos angiospermas morfológica y fisiológicamente diferentes. El inóculo consistió en el meristemo apical más tres primordios de hoja y algunos tejidos subyacentes de tallo. Los ápices de ambas plantas desarrollaron plantas completas en diferentes medios nutritivos. La importancia de Ball radica en que surgió que la perpetuación del crecimiento y organogénesis en meristemos apicales de angiospermas requiere de tallos subyacentes y primordios de hoja.

El primer resultado positivo fue reportado por Wetmore y Morel (1949), y Wetmore (1954), con criptógamas vasculares como Adiantum spp, Osmunda spp y Seleginella spp. Las puntas de esas plantas medían de 100 a 150µ de longitud y se desarrollaron en solución de Knop y 3% de sacarosa (este medo resultó inadecuado para plantas superiores).

Ball (1960) probó el cultivo de meristemos apicales de Lupinus albus L. en un medio que contenía aminoácidos, leche de coco, ácido giberélico y vitaminas, observando sólo una pequeña elongación del meristemos. Al repetir el experimento, dejó algunos primordios de hoja a los meristemos y obtuvo plantas completas. Con base en estos resultados Ball concluye que: a) El meristemo apical exhibe una dependencia hormonal y nutricional por el tallo subyacente y primordios de hoja, y b) El meristemo apical de angiospermas sufre una diferencia bioquímica que le impide producir ciertas sustancias esenciales para el crecimiento y mantenimiento de un meristemo determinado.

3.3.1 Descripción e importancia

En muchas especies lo anterior puede lograrse con tratamientos con calor de varios órganos in vitro, o de plantas compuestas, así como con la aplicación de productos químicos (Hollings, 1965). Sin embargo, ciertos virus han resistido todas las pruebas de erradicación por estos medios y se hacen necesarios otros métodos.

Actualmente la alternativa de más éxito es el cultivo de meristemos apicales, frecuentemente combinado con quimioterapia o con tratamientos de calor. Cuando estos métodos son usados, las plantas no solo son liberadas del virus, sino también de hongos y otros patógenos.

El primer cultivo con resultados satisfactorios fue el de Morel y Martín (1952), quienes cultivaron ápices de dalias infectadas con virus y lograron obtener plantas sana. Morel (1955) realizó un cultivo meristemático con Cymbidium, Cattleya y Phajus, obteniendo orquídeas libres de virus, y en 1960 reporta que es necesario hacer ciertas modificaciones en el medio, ya que géneros como Vlanda y Phalaenosis no responden favorablemente (citado por Lecoufle, 1969).

3.3 Plantas libres de patógenos

La tecnología para la obtención de plantas libres de patógenos es de gran utilidad para obtener altos rendimientos en cultivos de propagación vegetativa. El proceso pasa por dos etapas bien definidas, la primera es la etapa de laboratorio y la segunda es la etapa de invernadero. Ambas están estrechamente relacionadas, ya que para poder propagar plantas en invernaderos se debe contar con material procedente de cultivo de tejidos de laboratorio.

La propagación en invernaderos se caracteriza por que la propagación de las plantas que se instalan se realiza en un ambiente protegido del ingreso de insectos vectores trasmisores de virus, además de otras plagas. De igual modo el uso de sustrato desinfectado permite una propagación libre de patógenos y el uso de plántulas libres de virus procedentes de propagación ‘in vitro’.

El presente taller está orientado a desarrollar capacidades en la producción de plantas libres de patógenos en ambientes controlados (invernaderos ó cobertores) en los cultivos de fresa, ajo y camote.

El curso se dictará en la Estación Experimental Agraria Donoso – INIA, Huaral, donde también se realizará las prácticas en los invernaderos.

3.2.3 Rutas: Organogénesis y Embriogénesis somática

Organogénesis  Es la formación de un primordio unipolar a partir de una yema con el subsecuente desarrollo de este en un brote vegetativo, existiendo siempre una conexión entre los nuevos brotes y el tejido paterno. Estos brotes vegetativos son posteriormente puestos a enraizar en otra etapa, vía formación de primordios de raíces y el subsecuente enraizamiento final.  Los brotes pueden formarse directamente del explante (organogénesis directa) o indirectamente a partir de callos.  En contraste con la embriogénesis somática, en la vía organogénica para la formación de una planta completa, ya sea por la vía directa o indirecta, se requiere de una secuencia de medios de cultivo, ya que aquellos medios que favorecen el desarrollo de los brotes inhiben la formación de raíces y viceversa.

Hay dos formas de formación de yemas que son:

Formación de yemas axilares

Esta técnica se basa en la formación de brotes a partir de las yemas que se encuentran en las axilas de las hojas y primordios de las hojas, los cuales son divididos o subcultivados respectivamente. Este método a pesar de no ser el más rápido, ha sido el más utilizado para la propagación comercial debido en primer lugar a la facilidad con que se ha establecido en la mayoría de las especies y en segundo lugar a la estabilidad genética de las plantas regeneradas, siendo el sistema de regeneración en el cual se reportan los menores índices de variación genética.

La principal desventaja radica en la laboriosidad del proceso, lo cual implica altos costos por mano de obra, bajos coeficientes de multiplicación en comparación con otros sistemas de regeneración y escasa posibilidad de automatización del proceso productivo. No obstante existen posibilidades de automatizar algunas etapas del proceso con la utilización de birreactores y sistemas de inmersión temporal de los explantes.

Formación de yemas adventicias

Es la formación de Novo de yemas a partir de meristemos preexistentes o tejido no meristemático, las cuales se originan de una o de un pequeño grupo de células, cuando se cultivan los explantes en medios de concentraciones elevadas de citoquininas.

Con esta técnica es posible producir un mayor número de plantas por unidad de tiempo en comparación con el método de yemas axilares y a la vez presenta mayores posibilidades de mecanización automatización, existiendo ya varios ejemplos de utilización de birreactores para su producción. Sin embargo, al igual que el método de yemas axilares tiene la limitante de que el proceso productivo es realizado en dos etapas: producción de brotes y crecimiento enraizamiento. Adicionalmente presenta el inconveniente de que puede ser una fuente de variación genética debido al propio origen unicelular de las yemas adventicias. Este método ha tenido su mayor aplicación en la propagación de plantas ornamentales donde la ocurrencia de plantas fuera de tipo no es un problema.

Embriogénesis vegetal

La embriogénesis vegetal es el conjunto de procesos fisiológicos que conducen a la transformación de una sola célula, el cigoto, en un individuo multicelular más complejo el embrión contenido en la semilla madura. Requiere de fina regulación de multitud de elementos de desarrollo, que conducen a la elaboración de morfologías básicas (morfogénesis), el establecimiento de estructuras funcionalmente organizadas (organogénesis) y la diferenciación tisular. Además, debe generar las estructuras elementales de crecimiento activo en los sistemas modulares que son las plantas, esto es, los meristemos, así como las funciones necesarias para la ulterior supervivencia del embrión, como son la quiescencia y la germinación.

Durante la embriogénesis la planta tiene que superar varias etapas. Una es establecer el plan corporal básico del esporofito, el cual es reestructurado cuando se rompe la dormancia. Para establecer este plan, inicialmente se dan divisiones radiales que forman 3 sistemas tisulares básicos, el dermal, el basal y el vascular, luego se procede a las divisiones axiales que forman el eje apical (tallo) basal (raíz). Lo segundo es reservar tejido meristemático para la formación de estructuras postembrionarias y por último, debe establecer las reservas alimenticias para el embrión hasta que se vuelva autótrofo.

División del cigoto

Las algas pardas son un sistema modelo que se utiliza porque a diferencia de las angiospermas tiene fertilización externa y no cuenta con las múltiples capas de tejido. Con la primera división asimétrica del embrión de las algas pardas se establece la polaridad, esta división produce una célula más pequeña que forma el rizoide que es el homólogo a la raíz y es la estructura que ancla el resto de la planta, la otra célula es más grande y genera el tallus que es el cuerpo principal del esporofito. El punto de entrada del esperma establece la polaridad de la planta, por lo tanto esta entrada fija dónde será el rizoide terminal del eje apical-basal, el cual es perpendicular al plano de la primera división de la planta. La F-Auxina se acumula en el rizoide terminal. Sin embargo, la fijación de la polaridad puede ser anulada por la gravedad o la luz, estímulo que establecería una nueva posición para la división celular. Después del establecimiento de la polaridad, vesículas secretoras se mueven hacia el rizoide terminal del cigoto, las cuales contienen material para que el rizoide se comience a desarrollar y se forme una pared celular con una composición diferente de macromoléculas. Mantener la polaridad original depende de información en la pared celular.

En angiospermas, el establecimiento del plan corporal también comienza con una división asimétrica. La primera división da lugar a una célula basal y una terminal, la célula terminal da lugar al embrión y la célula basal, que es la que se forma más cerca del micrópilo, da origen al suspensor, el cual servirá como conducto de nutrientes. La hipófisis se da en la interface entre el suspensor y el embrión.

Establecimiento del meristemo

El meristemo apical del tallo y el meristemo apical de la raíz son cúmulos de células madre que continúan en la planta postembrionaria y dan lugar a la mayoría del cuerpo del esporofito. El meristemo de la raíz se origina parcialmente de la hipófisis en algunas especies. El resto de las estructuras del esporofito se originan del embrión. Evidencia genética ha demostrado que la formación del meristema de la raíz y del tallo son regulados de manera independiente.

Tarea: “Resumen”

Variación Somaclonal

Esta plenamente comprobado que ocurren modificaciones genéticas en las células y los tejidos cultivados in vitro. Muchas de estas modificaciones se manifiestan como mutaciones heredables a las progenies de las plantas regeneradas. Este fenómeno se conoce como variación somaclonal (Larkin y Scowcroft, 1981).

La variación somaclonal puede usarse, con muchas frecuencias, para recuperar la variación genética natural de una variedad. La variación somaclonal es superior también al mejoramiento por mutaciones inducidas puesto que en las plantas regeneradas que derivan de células individuales, la ocurrencia de mosaicos es mínima. En la mayor parte de los casos, por tanto, los somaclones pueden estabilizarse en una generación; las mutaciones, en cambio requieren  varias generaciones y retrocruces. La variación somaclonal puede causar una variación temporal (epigenetica) o una variación genética. Por definición, los cambios epigeneticos no se transmiten meioticamente, razón por la cual no son útiles en el fitomejoramiento. Una variación fenotípica tiene valor en el fitomejoramiento si proviene de una verdadera modificación del material genético, (Meins, 1983).

El origen de la variación no siempre es claro, y puede diferir entre una planta y otra. Puede ser por ejemplo, reordenamiento cromosómico,  considerando el principal mecanismo que genera la variación somaclonal; puede deberse también a un entre cruce (crosisng over) somático, a un intercambio de cromatidas hermanas, a una alteración de los neoclotidos por multiplicación.

Protoplastos Y aislamiento

El termino protoplastos se refiere a componentes vivos de las células vegetales que están rodeados solo por la membrana plasmática; en realidad, constituye células desnudas de una planta. Muchos protoplastos pueden resintetizar la pared celular, dividirse, formar colonias e incluso generar plantas. Los protoplastos sirven además como herramientas experimentales únicas para muchas investigaciones fisiológicas, biofísicas y bioquímicas. 

Aislamiento  El primer aislamiento de protoplastos vivos fue descrito por Klercker (1892), quien tuvo éxito al aislar protoplastos de cebolla usando métodos mecánicos. Aunque existe un método mecánico para aislar protoplastos, el método enzimático es actualmente la forma más importante y efectiva para ese propósito.

El método mecánico tiene, ante todo, un interés histórico, ya que su rendimiento es bajo, su procedimiento tedioso y su aplicabilidad limitada (Vasil et al., 1980) dicho método consiste en aplicar un choque osmótico para producir plasmólisis en las células, las cuales se rompen luego mediante un corte: luego se pueden liberar los protoplastos de las células rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmótico.

Enzimas que se utilizan: para el aislamiento de protoplastos por el método enzimático es necesario usar mesclas de enzimas, en lugar de usarlas individualmente. Se utilizan enzimas de las siguientes clases generales; células, driselasa, celulisina, meicelasa, macerasa,  hemicelulasas y pectinasas (Ruesink, 1980),

Cultivo de anteras y óvulos

Los métodos más ampliamente usados para la creación de haploides duplicados se valen de la hibridación interespecifica o intergenetica, y de cultivo de esporas (masculinas o femeninas). La alternancia de generaciones gametofiticas y esporofiticas en las plantas superiores. Los granos de polen  de la papa silvestre (Solanum phereja), contienen solo un núcleo generativo causado por un gametogénesis anormal. Las células gametofiticas (microsporas o megasporas) se puede inducir, en el cultivo, a abandonar su curso ontogenetico normal para seguir una vía esporofitica que conduzca a la formación de esporofitos haploides, el proceso se llama androgénesis cuando las microsporas originan embriones y plantas y ginegenesis cuando tiene lugar en el cultivo de óvulos y de ovarios (Bossoutrot y Hosemans, 1985). La androgénesis, obtenida mediante el cultivo de anteras, es la técnica más ampliamente usada para la inducción de haploides y ha demostrado tener gran importancia para el fitomejoramiento.

Anteras mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa especifica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar embriogénesis o callo. Transferidos estos medios de regeneración, se forman plantas. En la mayoría de los casos se producen plantas haploides estériles, pero en algunas especies ocurre una duplicación espontanea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y de regeneración de la planta.

Desde que Guha y Maheshwari lo descubrieron en 1964, el cultivo de anteras se ha extendido a mas de 150 especies (Dunwel, 1986). Las limitaciones técnicas que afectan a muchas especies, como la renuncia a la regeneración de plantas y los bajos rendimientos de las plantas haploides, han ocasionado el lento desarrollo del mejoramiento genético mediante el cultivo de anteras.

Condiciones que afectan el cultivo de anteras

Genotipo de las plantas donadoras, el genotipo es quizás el factor más importante que afecta el cultivo de anteras. La variabilidad en la respuesta al cultivo de anteras se ha hallado entre especies y dentro de ellas, y se ha demostrado la heradabilidad de esta respuesta (Wenzel y Uhrig, 1981). Dicha capacidad para el cultivo de anteras es particularmente evidente en cultivares de arroz de los tipos Japónica e Indica, (Keller et al., 1987). Además de la capacidad genotípica general para el cultivo de anteras, se han determinado, en la cebada y en el trigo, rasgos heredados independientemente respecto a componentes específicos de la androgénesis, como la inducción de callo y la regeneración de plantitas (Wenzel ec al., 1985; Lazar et al., 1984). Demostraron que ambos rasgos eran altamente heredables.

3.2.2 Tejidos empleados

Los explantes deben ser esterilizados antes de ser establecidos    en condiciones     de cultivo.

Protocolo tipo de esterilización superficial                de material vegetal:

Ø  Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos.

Ø  Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) al 5 a 20%, entre 5 y 3 minutos.

Ø  Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas    bicloruro de mercurio        (HgCl₂), entre el 0,01 y 0,05%.

Ø  Enjuagues con abundante agua estéril (4 ó 5 veces).

Ø  En el caso del HgCl₂, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil  de eliminar.

Técnicas de cultivo (Tipo de tejidos empleados):

Ø  Cultivo de segmentos nodales

Ø  Cultivo de semillas

Ø  Cultivo de anteras

Ø  Cultivo de meristemos

Ø  Cultivo de raíces, hojas, tallos, cambium

Ø  Cultivo de embriones

Ø  Cultivo de ápices

Ø  Cultivo de tubérculos

Ø  Cultivo de rizomas

Ø  Cultivo de bulbos

3.2.1 Descripción e Importancia

La reproducción "in vitro" o micropropagación vegetal es utilizada en cultivos de importancia económica. Aporta grandes logros a la agricultura.

 Posiblemente el término “in vitro” ya no resulte extraño. El lenguaje corriente y los medios de comunicación suelen referirse a técnicas de fertilización in vitro. Básicamente, se trata de técnicas que se realizan en laboratorios y que permiten la unión de las células sexuales, óvulos y espermatozoides en recipientes de vidrio (de allí “in vitro”).

En el caso de los seres humanos, al formarse el embrión fuera del cuerpo materno en el laboratorio, ya en sus primeras etapas se lo transfiere al útero materno donde sigue su desarrollo hasta el nacimiento. La fecundación in vitro en humanos se logró por primera vez en 1978.

Las plantas le llevan una ventaja a la fecundación in vitro humana. Ya en 1902 se realizaron las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales in vitro. Y en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de microorganismos (hongos, virus y bacterias) hasta convertirse en plantas adultas.

Plantas in vitro

El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio), incluye diferentes técnicas destinadas a multiplicar, entre otros, material vegetal o animal. No es exactamente lo mismo que la fecundación in vitro en humanos. El cultivo de tejidos vegetales consiste en tomar una porción de la planta (explanto) y proporcionarle artificialmente un medio de cultivo nutritivo esterilizado, que permita regenerar una o muchas plantas.

El objetivo de cultivas plantas in vitro puede ser, por ejemplo, propagar masivamente plantas en vías de extinción, o plantas difíciles de propagar por otros métodos, o para clonar (copiar) individuos que tienen características agronómicas deseables (mejores frutos, resistentes a las sequías, etc.), para obtener plantas libres de virus, para conservar la diversidad genética de una población, entre otras aplicaciones.

La reproducción de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que las células vegetales son totipotenciales. Esto significa que las células vegetales poseen la capacidad de desarrollar un nuevo individuo completo, sin que sea necesaria la unión de células sexuales. Es decir que a partir de unas pocas células, se puede obtener un organismo completo, de forma asexual.