4.2. Corte y unión de moléculas de ADN.

A diferencia de las proteínas, los genes no existen en unidades independientes, sino que confieren regiones de una molécula de ADN  de gran tamaño. Aunque es posible fragmentar el ADN al azar, es muy difícil que estas porciones contengan un determinado gen. Así, el purificar un determinado gen constituyó un verdadero problema hasta la aparición de las endonucleasas de restricción.  Estas enzimas, que pueden aislarse de bacterias, cortan el ADN de doble cadena en lugares discretos, definidos por la secuencia de nucleótidos, produciendo fragmentos de ADN de tamaño definido. Distintas especies de bacterias fabrican diferentes endonucleasas de restricción y cada una de ellas posee especificidades de secuencia, siendo relativamente fácil encontrar una endonucleasa de restricción que libere un fragmento de ADN que incluya un determinado gen. El tamaño del fragmento liberado puede utilizarse para purificar el gen de una mezcla. Una vez purificado, puede amplificarse el fragmento de ADN mediante clonación y determinarse la secuencia de nucleótidos que se encuentran en la molécula mediante la secuenciación.

Las endonucleasas de restricción son producidas por un amplio número de bacterias, a las que las protegen degradando  moléculas de ADN que han sido transportadas al interior de las mismas por medio de virus. Así, una bacteria puede eliminar una porción de ácido nucleído viral que ha ingresado a su genoma.   Cada enzima reconoce una secuencia específica de ADN de entre cuatro y ocho nucleótidos. Cuando estas secuencias son propias del genoma bacteriano están protegidas del corte por medio de la metilación; cuando estas secuencias se presentan en un ADN extraño, no se hallan metiladas por lo cual resultan como blanco del ataque de las endonucleasas. Se han aislado y purificado muchas nucleasas de restricción de diferentes especies bacterianas y actualmente existen más de cien de estas enzimas en el mercado. Algunas de las endonucleasas de restricción cortan el ADN generando secuencias cortas de ADN de cadena sencilla en los extremos del fragmento. A este tipo de extremos se los conoce como “adhesivos o cohesivos”, pues es complementario de otra secuencia que genera la misma endonucleasa en otro fragmento. Los extremos cohesivos permiten unir fácilmente fragmentos de ADN obtenidos con la misma enzima.