sábado, 8 de diciembre de 2012

4.4. Bioética y revolución biotecnológica.



La bioética médica, que ha sido la dominante durante las tres pasadas décadas, muestra señales de agotamiento por el hecho de haberse consumado como paradigma de la medicina y la atención de la salud, el paradigma bioética (biocultural) respecto del paradigma biológico tradicional. Bioética vendría a ser así la expresión normativa de transformaciones de la actual medicina que configuran su nueva filosofía. De uno a otro debate, el inicial sobre el aborto en los 70 y el terminal sobre la eutanasia en los 90, entre el a y el w en el dominio de la vida, se habría extendido todo el espectro posible de la bioética médica.

El paradigma bioética significa una nueva manera de entender la medicina, a partir de una tecnociencia biomédica pigmaliónica que hace del cuerpo humano un objeto cada vez más plástico, al cual no se contenta sólo con restaurar sino que aspira a transformar o perfeccionar; a partir de un individualismo narcista que legitima como decisiones autónomas tratamientos médicos o intervenciones que satisfacen deseos personales relativos a nuestra biología (como por el momento la reproducción, la apariencia física, la sexualidad), a partir de una medicalización knockista de la vida que convierte a la salud en un bien de consumo similar a otros bienes humanos como el bienestar o la felicidad. Pigmalión o la medicina del deseo, Narciso o la utopía de la salud, Knock o la medicalización de la vida conforman la narrativa posmoderna de la medicina y la atención de la salud que origina el paradigma bioética, cuya clave es el carácter normativo y la inversión del sentido (tradicional) de los conceptos de salud y enfermedad.

La bioética global, que permaneció adormecida hasta su revalidación incluso por el mismo Potter a fines de la última década, ha tomado la posta de la bioética clínica en el cambio de siglo y milenio, a favor del escenario catastrófico de la ecología, el avance vertiginoso de la revolución biotecnológica y la crisis del orden mundial globalizado. Globales son los temas que abren la agenda bioética de este siglo, como la decodificación del genoma humano, la investigación con células estaminales, la clonación, los xenotrasplantes, la epidemia HIV/SIDA y ahora la no descartable reversión apocalíptica de los asuntos humanos. La necesidad de contenciones normativas se extiende hoy más allá de las fronteras nacionales -por ejemplo, un consenso "geoético" sobre los límites de la biotecnología-, pero los obstáculos a los acuerdos éticos globales son formidables, dadas las diferencias éticas, religiosas y culturales del mundo.


4.3. Legislación.



Hay un consenso sobre la importancia de realizar investigación interdisciplinaria sobre los transgénicos, a través de la aplicación de las ciencias “ómicas” (genómica. proteínica; etc.), ecología, bioinformática, entre otras. Lo anterior es importante ya que hay académicos que consideran que los transgenes pudieran generar respuestas no evidentes en el organismo receptor; aunque algunos otros pensamos que éste no sería el caso, ya que como se señaló, la transferencia horizontal del material genético y la reorganización del genoma son fenómenos que ocurren permanentemente en la naturaleza, y los transgénicos son creados por transferencia horizontal y reorganización del genoma y por ello son organismos de bajo riesgo. Sin duda estos estudios generarán conocimientos más completos e integrales de los OGMs, que ayudarán a responder algunas de las preguntas en este asunto.

Además, es importante incorporar también estudios sociales y económicos del uso de esta tecnología (es decir, impacto de las patentes en los países pobres, aspectos bioéticos y sociales, relacionados con la derrama de los beneficios a los agricultores, etc.).
Por lo anterior, es indispensable la formación de recursos humanos de manera interdisciplinaria y el fortalecimiento de la infraestructura de investigación y de instancias con capacidad para evaluar integralmente los OGMs y su utilización. El establecimiento de los medios para la difusión de la información generada en la materia, es también estratégico.














4.2.5.2. Animales transgénicos.



Normalmente, en los organismos superiores animales o vegetales la información genética se transmite por mecanismos de reproducción sexual; es lo que se conoce como transmisión genética vertical. Sin embargo, hace ya unos veinte años se logró obtener los primeros ratones transgénicos mediante transferencia génica por inyección directa de ADN extraño en un cigoto obtenido por fecundación in vitro; es decir, se trataba de una transmisión genética horizontal, también llamada transgénesis.

A partir de las experiencias de Gordon, Ruddle y colaboradores iniciadas en 1980 en las que inyectaron ADN de ratón en uno de los pronúcleos de un cigoto de la misma especie, se inició una nueva era en la manipulación genética de embriones de mamíferos. Al año siguiente, Gordon y Ruddle (1981) demostraban la integración y transmisión estable a través de la línea germinal de genes inyectados en pronúcleos de cigotos de ratón obtenidos por fecundación in vitro. Eran los primeros ratones transgénicos. El paso siguiente consistió en probar que también se podían obtener ratones transgénicos que incorporaran en su genoma un gen (transgén) de otra especie. Así, Palmiter y colaboradores (1982) obtuvieron ratones transgénicos gigantes al inyectar en el pronúcleo de un cigoto el gen de la rata que codifica para la hormona del crecimiernto. Incluso, se obtuvieron también ratones transgénicos gigantes cuando el transgén introducido era el gen humano que codifica para la hormona de crecimiento (Palmiter et al., 1983).

3505.- El ratón transgénico, que lleva incorporado el gen de la hormona de crecimiento de la rata, tiene un aumento de tamaño del 80% en comparación con un ratón normal
Como era de esperar, a los ratones transgénicos siguieron los conejos, ovejas y cerdos transgénicos a los que se les había introducido por microinyección en uno de los pronúcleos del cigoto el ADN del gen humano que codifica para la hormona de crecimiento, en un intento de aumentar el tamaño de tales animales (Hammer et al., 1985). Sin embargo, este avance científico no tuvo aplicación zootécnica porque la presencia del transgén modifica la fisiología del animal transgénico, produciendo efectos colaterales perjudiciales para su desarrollo. De cualquier manera, la era de la trangénesis animal había comenzado como una realidad imparable.















4.2.5.1. Plantas transgénicas.



La planta transgénica contiene uno o más genes que han sido insertados en forma artificial en lugar de que la planta los adquiera mediante la polinización. La secuencia génica insertada (llamada el transgen) puede provenir de otra planta no emparentada o de una especie por completo diferente: por ejemplo, el maíz Bt, que produce su propio insecticida, contiene un gen de una bacteria. Las plantas que tienen transgenes a menudo son llamadas genéticamente modificadas o cultivos GM, si bien en realidad todos los cultivos han sido genéticamente modificados con respecto a su estado silvestre original mediante la domesticación, la selección y el mejoramiento controlado a través de períodos prolongados. En este sitio de la red usaremos el término transgénico para describir una planta de cultivo que tiene transgenes insertados.

Por qué hacer plantas de cultivo transgénicas?
El fitomejorador trata de reunir una combinación de genes en una planta de cultivo que la hagan tan útil y productiva como sea posible. Según dónde y para qué propósito se cultive la planta, los genes deseables pueden proporcionar características tales como un rendimiento más alto o mejor calidad, resistencia a las plagas o enfermedades o tolerancia al calor, el frío y la sequía. Combinar los mejores genes en una sola planta es un proceso largo y difícil, en especial cuando el fitomejoramiento tradicional se ha limitado al cruzamiento artificial de plantas dentro de la misma especie o entre especies estrechamente emparentadas para reunir diferentes genes. Por ejemplo, un gen para aumentar el contenido proteínico de la soya no podía ser transferido a un cultivo completamente distinto como es el maíz usando las técnicas tradicionales. La tecnología transgénica permite a los fitomejoradores reunir en una sola planta genes útiles de una amplia gama de fuentes, no sólo de la misma especie de cultivo o de plantas muy emparentadas. Esta tecnología proporciona un instrumento para identificar y aislar genes que controlan características específicas en una sola clase de organismos y para trasladar copias de esos genes a otro organismo muy diferente, que entonces tendrá también esas características. Este poderoso instrumento permite a los fitomejoradores hacer lo que siempre han hecho, generar variedades de cultivos más útiles y productivas que contienen combinaciones nuevas de genes, y además ampliar las posibilidades más allá de las limitaciones impuestas por la polinización cruzada y las técnicas de selección tradicionales.



















4.2.5. Tecnología de ADN Recombinante en la agricultura.



APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE

El vector que se utiliza contiene secuencias de ADN que al ser replicadas confieren resistencia a antibióticos específicos. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada en el campo de la medicina y ha permitido el desarrollo de importantes avances terapéuticos como por ejemplo la producción de insulina recombinante.

Permite además la posibilidad de utilizar plantas y alimentos transgénicos, así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. El uso de ADN recombinantes puede también tener un impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el propio planeta. Con el uso de ADN recombinante se ha logrado obtener plantas transgénicas resistentes a insectos, hongos, bacterias y herbicidas, con mejores características de calidad durante poscosecha y con alto contenido nutricional. También ha permitido la clonación, expresión y producción mediante esta técnica de diversos antígenos, por ejemplo, la vacuna contra la hepatitis B5 y la vacuna contra el virus del papiloma humano.

El proceso de producción de un ADN recombinante comienza con la identificación desde un organismo de una secuencia de ADN de interés con el fin de propagarlo en otro organismo que carece de la secuencia y, por ende, del producto proteico de esa secuencia de ADN. Así se pueden producir cantidades ilimitadas de la proteína codificada por el susodicho gen.








4.2.4. Vectores de clonación.



Los vectores son unidades de ADN que se autoreplican en un microorganismo o células humanas y los cuales pueden portar fragmentos de ADN de origen diverso. El vector debe contar con los elementos que le permitan ser replicados y mantenidos por la maquinaria celular hospedadora.
Los vectores son propagados en hospedadores que pueden ser células de E. coli, levadura (S. cerevisina) o células mamíferas. Los vectores pueden ser estructuras sencillas como plásmidos o muy complejos como los cromosomas artificiales de levadura (YAC) (5) y los cromosomas artificiales mamíferos (MAC) (6).
los vectores tienen diferente capacidad de portar longitudes variables de secuencias de ADN. Los cromosomas artificiales mamíferos se vislumbran como vectores de terapia genética de condiciones causada por genes mayores como el de la distrofina, cuya disfunción causa la distrofia muscular de Duchenne-Becker, gen que tiene una longitud de secuencia de 2.4 Mb (7). 




4.2.3. Clonación de genes.



Clonación de genes, el proceso mediante el cual puede aislarse un gen de entre todos los genes diferentes que existen en un organismo, lo que permite realizar su caracterización. Esto se consigue con la preparación de una batería de bacterias que contienen todos los genes distintos presentes en un organismo de manera que cada una de ellas contiene un solo gen. Esto se lleva a cabo efectuando cortes del ADN de un individuo. Otra alternativa es la de crear un conjunto de todas las secuencias de ADN expresadas en una célula específica mediante la producción de copias complementarias de ADN a partir del ARNm hallado en dichas células (v ase Biología molecular). En ambos casos, los fragmentos de ADN se unen a un vector, un virus bacteriano conocido como bacteriófago o a un ADN circular denominado plásmido, que se introduce en una bacteria de forma que cada una adquiere solo una copia del vector y por tanto recibe solo un fragmento de ADN.

Los grupos preparados de esta forma se pueden examinar para identificar la bacteria que contiene el gen objeto de estudio. Entonces, se toma esta bacteria y se hace crecer para producir un clon de bacterias idénticas. Como el vector que contiene el ADN insertado se replica siempre que la célula bacteriana se divide, se produce la cantidad suficiente de ADN insertado clonado necesaria para caracterizar el gen. De esta manera es posible estudiar los genes que codifican proteínas que tienen un interés especial, o aquellos cuya inactivación, consecuencia de una mutación, origina una enfermedad específica. Por ejemplo, podemos determinar su secuencia y la naturaleza de la mutación que da lugar a una enfermedad.
Con posterioridad, el gen se puede expresar en la célula bacteriana para producir la proteína específica que se puede emplear en el tratamiento de enfermedades como la diabetes mellitus (insulina) o el enanismo (hormona del crecimiento). Recientemente, se han podido introducir genes funcionales clonados en los individuos, para tratar una enfermedad de forma más directa. Es probable que el empleo de estos procedimientos de tratamiento genético con ADN clonado aumente en el futuro.




















4.2.2. Enzimas de unión.



Algunas proteínas tienen la capacidad de modificar los ligandos a los cuales son unidos, es decir, actúan como catalizadores moleculares. Su función es acelerar en varios órdenes de magnitud el ajuste de del equilibrio químico y la velocidad de reacciones químicas, que sin ellas podrían tardar una eternidad. Estas proteínas son las denominadas enzimas. Para realizar esta aceleración del proceso lo que consigue la enzima es lograr la disminución de la energía de activación de la reacción.

Las enzimas dirigen las transformaciones químicas y energéticas que tienen lugar en cada célula. Pero para realizar estas funciones básicas y vitales para nuestra vida deben tener una capacidad de interaccionar de forma específica y reversible con ligados, que viene dada por su conformación espacial en el lugar de unión. Para que la enzima modifique el ligando (sustrato a partir de este momento) este debe “encajar” en el lugar de unión de la enzima. Por esto decimos que hay complementariedad geométrica entre enzima y sustrato.

Los lugares de unión acostumbran a estar en unas hendiduras de la superficie de la enzima, formando como un “bolsillo” en el cual entra el sustrato. De esta manera la superficie de interacción entre sustrato y enzima es mayor, y las posibilidades de conferir especificidad a la unión con el sustrato aumenta. La especificidad de la unión es tan alta que la enzima es capaz de distinguir entre sustratos esteroisómeros, por lo tanto decimos que las enzimas presentan estero especificidad. La estero especificidad puede servir en casos concretos para separar rutas de formación y degradación de productos, que se realizan de forma simultánea. Este hecho se debe a que las enzimas son moléculas asimétricas.

La unión se mantiene gracias a las fuerzas de enlaces no covalentes entre átomos del sustrato y la enzima, como enlaces de Van der Waals, enlace por puente de hidrógeno o puentes salinos, durante la catálisis, pero la unión es temporal, por tanto cuando la reacción enzimática finaliza se separan la enzima y el producto (ya no hablamos de sustrato después de la catálisis, ya que tiene una conformación modificada por la enzima).












4.2.1. Enzimas de corte.



Un enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.

El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercanía (Apareamiento de Watson & Érick). Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos.Restricción de SmaI dejando extremos romos.

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas.Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizómeros. Por ejemplo, están los isoesquizómeros Asp718 y KpnI. El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbiólogos Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las endonucleasas de restricción lo que condujo al desarrollo de la tecnología de ADN recombinante. El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos. Uno de los campos en los que el uso de enzimas de restricción ha tenido mayor implicación ha sido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.

















4.2. Corte y unión de moléculas de ADN.



A diferencia de las proteínas, los genes no existen en unidades independientes, sino que confieren regiones de una molécula de ADN  de gran tamaño. Aunque es posible fragmentar el ADN al azar, es muy difícil que estas porciones contengan un determinado gen. Así, el purificar un determinado gen constituyó un verdadero problema hasta la aparición de las endonucleasas de restricción.  Estas enzimas, que pueden aislarse de bacterias, cortan el ADN de doble cadena en lugares discretos, definidos por la secuencia de nucleótidos, produciendo fragmentos de ADN de tamaño definido. Distintas especies de bacterias fabrican diferentes endonucleasas de restricción y cada una de ellas posee especificidades de secuencia, siendo relativamente fácil encontrar una endonucleasa de restricción que libere un fragmento de ADN que incluya un determinado gen. El tamaño del fragmento liberado puede utilizarse para purificar el gen de una mezcla. Una vez purificado, puede amplificarse el fragmento de ADN mediante clonación y determinarse la secuencia de nucleótidos que se encuentran en la molécula mediante la secuenciación.

Las endonucleasas de restricción son producidas por un amplio número de bacterias, a las que las protegen degradando  moléculas de ADN que han sido transportadas al interior de las mismas por medio de virus. Así, una bacteria puede eliminar una porción de ácido nucleído viral que ha ingresado a su genoma.   Cada enzima reconoce una secuencia específica de ADN de entre cuatro y ocho nucleótidos. Cuando estas secuencias son propias del genoma bacteriano están protegidas del corte por medio de la metilación; cuando estas secuencias se presentan en un ADN extraño, no se hallan metiladas por lo cual resultan como blanco del ataque de las endonucleasas. Se han aislado y purificado muchas nucleasas de restricción de diferentes especies bacterianas y actualmente existen más de cien de estas enzimas en el mercado. Algunas de las endonucleasas de restricción cortan el ADN generando secuencias cortas de ADN de cadena sencilla en los extremos del fragmento. A este tipo de extremos se los conoce como “adhesivos o cohesivos”, pues es complementario de otra secuencia que genera la misma endonucleasa en otro fragmento. Los extremos cohesivos permiten unir fácilmente fragmentos de ADN obtenidos con la misma enzima.  

















4.1. Transformación de organismos.



En determinadas condiciones fragmentos de ADN exógeno o ADN transformante (tamaño superior a 3 x 105 dalton y longitud comprendida entre 5 x 106 y 15 x 106, que equivale a 200.000 pares de bases) con estructura helicoidal intacta pueden unirse a células bacterianas competentes y entrar en su interior. La entrada de estos segmentos necesita de la presencia de iones de k+, Mg++ y Ca++. El ADN entra en el espacio periplasmático, entre la pared celular y la membrana plasmática, allí una endonucleasas corta las dobles hélices en fragmentos de menor tamaño, posteriormente se degrada una de las dos hélices, de manera que lo que entra en el citiplasma es ADN de una hélice (monocatenario). Estos fragmentos de ADN monocatenario o ADN transformante pueden sustituir a fragmentos de ADN homólogo del cromosoma principal bacteriano mediante un mecanismo especial de recombinación. La recombinación genética tiene lugar entre el ADN transformante y el ADN de la bacteria receptora y se detecta por la aparición de bacterias descendientes transformadas para algún carácter. La existencia de este mecanismo permite construir Mapas genéticos de transformación.

Concepto de ligamiento en experimentos de transformación: dos genes o dos marcadores o dos loci cualesquiera se consideran como ligados cuando van juntos en el mismo segmento de ADN transformante o exógeno. En este caso, la frecuencia con la que aparecen las bacterias descendientes dobles transformadas DT (han cambiado para los dos genes o loci estudiados con respecto a la bacteria receptora) es mayor que la frecuencia de las bacterias descendientes simples transformadas ST (han cambiado para un solo gen o un solo locus con respecto a la receptora).

Supongamos que tenemos una bacteria receptora auxotrofa (a- b-), incapaz de sintetizar los compuestos a y b. Por tanto, para crecer necesita que se añadan a las medio dichas sustancias. Supongamos que el ADN transformante o exógeno procede una bacteria prototrofa (a+ b+) que si es capaz de sintetizar los compuestos a y b, por tanto, no necesita que se añadan al medio dichas sustancias. Si los dos genes implicados en la producción de a y b están ligados y van en el mismo segmento de ADN transformante, podemos considerar tres regiones (I, II y II) en las que se puede dar entrecruzamiento. Un cuestión importante a tener en cuenta, es que el número de entrecruzamientos (sobrecruzamientos) a considerar debe ser siempre par (2, 4, 6, etc.), ya que si se diera un entrecruzamiento, tres o cinco, el cromosoma principal de la bacteria receptora quedaría abierto dejando de ser circular. El número de sobrecruzamientos necesario para que aparezca una bacteria DT es dos, uno en la región I y otro en la región III.














Portada


ISTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

ING. EN AGRONOMIA

VII Semestre

ASIGNATURA: BIOTECNOLOGIA
 VEGETAL

Unidad IV: “DNA Recombinante”



Prof. Ing. Francisco Javier Puche Acosta

Alumno: Baldemar Santana Peñaloza

miércoles, 28 de noviembre de 2012

3.5.2.3 Conservación del germoplasma



La conservación de la biodiversidad constituye un objetivo prioritario en un escenario en que las relaciones entre el desarrollo tecnológico y la conservación del ambiente ocupan crecientemente el debate público. En particular, la conservación de los recursos filogenéticos de interés para la agricultura es un factor ampliamente reconocido para contribuir al desarrollo sostenible de la misma y a la conservación de los recursos naturales. Uno de los ventajas más destacables del cultivo de tejidos in vitro es su posibilidad de propagar a gran escala cualquier material vegetal con mínimo riesgo de introducir o reintroducir patógenos y con alto grado de estabilidad genotípica. Por esta razón, han encontrado sus aplicaciones en la conservación e intercambio de recursos fitogenéticos se ha incrementado aceleradamente.
Tradicionalmente, la conservación de recursos fitogenéticos se ha basado en dos metodologías: ex situ e in situ. La conservación ex situ incluye al cultivo de células y/o tejidos vegetales (bancos de germoplasma in vitro). Los métodos de conservación in situ contemplan la preservación de las especies de interés en su hábitat natural. La criopreservación consiste en la conservación a temperaturas ultra bajas (-196°C) en un medio criogénico como el nitrógeno líquido. Durante las últimas décadas se ha avanzado mucho en el estudio de la respuesta del material vegetal a bajas temperaturas. Como parte de ello, se han estudiado los procesos fisiológicos y bioquímicos involucrados en la criopreservación y se han investigado las condiciones que posibilitan la preservación de la viabilidad del material vegetal almacenado por este método.

Los bancos de germoplasma in vitro posibilitan el mantenimiento a largo plazo de material vegetal en medios sintéticos de cultivo, bajo condiciones controladas de luz, fotoperiodo y temperatura. El manejo de este material no difiere demasiado de los procedimientos generales utilizados para la micropropagación vegetal. Ciertas variables, tales como la concentración de los compuestos osmóticamente activos, la concentración del agente gelificante inerte, la temperatura de cultivo y la luz, son ajustadas de manera de determinar una disminución de la tasa metabólica del material vegetal. De esta manera, se logra minimizar la manipulación y espaciar los subcultivos, lo que contribuye al descenso de los costos de mantenimiento. Una práctica general consiste en disminuir la intensidad lumínica y reducir la temperatura. Bajo estas condiciones restrictivas (por ejemplo, en oscuridad y a 4°C), es posible conservar plántulas de Fragaria x ananassa (frutillas o fresas) durante años, con el agregado esporádico de gotas de medio de cultivo fresco al material en conservación. Las condiciones estándar de cultivo in vitro sólo pueden utilizarse para conservación a mediano plazo de especies de crecimiento lento, como por ejemplo Coffea arabiga. Las plántulas de café micropropagadas pueden ser conservadas en un medio de cultivo estándar a 27°C, sin necesidad de ser repicadas o subcultivadas periódicamente a medio fresco, durante un año.















3.5.2.2 Suprencion de crecimiento



Como se discutió antes, siempre existe un riesgo, mayor o menor, de inestabilidad citogenética cuando se conserva el germoplasma mediante el cultivo de tejidos in vitro a largo plazo. Este riesgo se puede minimizar utilizando tejidos organizados (meristemos, yemas y cultivos derivados) y reduciendo la tasa de crecimiento mediante la temperatura baja. Con forme se reduce la temperatura de un tejido, el metabolismo celular disminuyendo hasta llegar a un estado de “suspensión animada” cuando la temperatura alcanza niveles inferiores a -150 ªC; a esta temperatura, los procesos biológicos han cesado y las posibles causas de inestabilidad se habrán, por tanto, minimizado o eliminado.

Se han discutido hasta aquí los aspectos relacionados con la conservación in vitro; se discutirán ahora estos aspectos pero aplicándolos a la yuca. (Manihot esculenta Crantz), cultivo que ha sido objeto de investigación profunda en la unidad de Investigación en Biotecnología del CIAT.

3.5.2.1 Factores que limitan el crecimiento



El crecimiento rápido de los cultivos a tasas mortales exige más mano de obra y aumenta la posibilidad de pérdidas debidas a accidentes o a contaminación microbiana durante la repetición continua de los subcultivos; es necesario entonces reducir el mínimo la frecuencia de los subcultivos, con lo que se logra además minimizar la posibilidad de variación genética.
El método consiste en mantener los cultivos (Yemas, plántulas derivadas de nudos o directamente de meristemos) o químicas (composición del medio de cultivo) que permite extender al máximo el intervalo de transferencia a los medios frescos, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos.

La tasa de crecimiento de los cultivos in vitro puede controlarse empleando, principalmente, los siguientes factores; temperatura, nutrimentos inorgánicos y orgánicos, reguladores del crecimiento, y concentración osmótica del medio.
Otros factores, como el tamaño de los tubos de ensayo o de los frascos, la calidad y concentración del agente gelificante, la adición de carbón activado al medio, la limitación de la oxigenación, la intensidad de la luz y del fotoperiodo, entre otros, son también importantes en el control del crecimiento.



3.5.2 Métodos de conservación



Crioconservación  es la conservaciónón de material biológico a muy bajas temperaturas. Rango -20 ºC a -196 ºC (nitrógeno líquido) El nitrógeno líquido es la temperatura práctica más baja disponible. A la temperatura de equilibrio, la difusión molecular es extremadamente lenta y la probabilidad de que ocurran reacciones químicas es prácticamente nula

1. con crecimiento
Ø  Transferencia seriada

 2. con metabolismo limitado
Ø  Baja concentración de nutrientes

3. con metabolismo detenido
    3.1  Congelamiento (crioconservación)
    3.2  Deshidratación
  L-drying: secado desde la fase líquida, silicagel, celulosa (papel), suelo, perlas de porcelana  Liofilización (freeze-drying)