2.3.7.4 Manejo del material trasplantado

Luego de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y  cubiertos con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un ambiente húmedo  a nivel del sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor( temprano en la mañana o en la última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro, generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia.

2.3.7.3 Trasplante y adaptación bajo condiciones de invernadero

Las plantas enraizadas, deben ser aclimatadas a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarán  en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada. La elección de un sustrato  con buenas características físicas, es clave para el éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos  un sustrato  suelto, poroso,  con mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado, para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes  y muy variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando.   

Ø  Crecimiento en condiciones no controladas

Ø  Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente

Ø  Humedad relativa variable

Ø  Estomas funcionales

Ø  Presencia de pelos radiculares

Ø  Presencia de cera en la cutícula

2.3.7.2 Desinfección o esterilización del sustrato

Si el fungicultor planea obtener producciones bajo un sistema de control absoluto y libre de factores que puedan alterar la calidad  y la productividad, necesariamente tiene que realizar estos cultivos sobre sustratos biológicamente descontaminados o libres de agentes  que puedan producir los perjuicios señalados.  La única excepción la constituye  el cultivo de ciertos hongos que se  realiza directamente sobre Sustratos Naturales como troncos y ramas, donde el hongo es inoculado directamente sobre los sustratos el que no ha tenido ningún tipo de tratamiento para disminuir la carga de agentes biológicos contaminantes. Esto se puede realizar sin problemas por que en la incubación y gran parte del periodo de fructificación se permite que el cultivo se realice con la corteza de los propios troncos. Esta corteza constituye una barrera física y química muy  efectiva contra la invasión de hongos contaminantes. Sin embargo, a pesar de lo anterior, muchos troncos se contaminan por los cortes (en la superficie transversal), pero estas contaminaciones se consideran tolerables en el cultivo.

2.3.7.1 Tipos de sustratos

Un medio ideal de propagación, debe estar provisto de suficiente porosidad para permitir una buena aireación y una alta capacidad de retención de agua, debe tener un buen drenaje y estar libre de patógenos (Hartmann et al., 1992).

Fibra de Coco: Tierra resultante del compostaje de la corteza de coco. Su PH oscila entre 5,6 y 6,6, es decir se trata de una tierra ácida.

Tierra de Castaño: Resultado del compostaje de troncos y corteza vegetal. Su PH es igualmente ácido.

Compost: De color pardo oscuro y poco peso. Su origen son residuos vegetales. PH más o menos neutro.

Turba rubia/negra: Se trata de materia vegetal descompuesta en ausencia de oxígeno. La turba negra presenta un grado de descomposición superior al de la turba rubia. Es un material con escaso valor nutritivo para la planta que tiende a retener la humedad demasiado tiempo cuando está empapado y se vuelve casi impermeable cuando se seca, propiedades un tanto problemáticas para usar en una mezcla.

2.3.7 Trasplante al sustrato

En el momento en que se extraen los explantes enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante.

Crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

Las plántulas recién enraizadas son sensibles a los cambios ambientales y esto va a depender del éxito o el fracaso.

2.3.6.4 Preadaptacion y trasplante

Al transcurrir los días de preaclimatación, las plantas fueron retiradas de la condición in vitro, para ser trasladadas al sustrato, en invernadero. Las plantas se retiraron de la condición  in vitro, y sus raíces se lavaron cuidadosamente, para retirar restos adheridos de agar, y evitar con esto la proliferación de patógenos en el sustrato. Posteriormente se sumergieron en una mezcla de Benlate más Captan, con una concentración de 1,2 g/l respectivamente por tres minutos.

Para el trasplante se utilizó como contenedores, vasos de plumavit de 230 ml, los cuales fueron lavados y asperjados con una solución de hipoclorito de sodio a 1%. En la base de estos contenedores se realizó cuatro perforaciones, para con ello favorecer el drenaje. Posteriormente, se procedió a llenar los contenedores a dos tercios de su capacidad con una mezcla de sustrato, previamente esterilizado en autoclave durante 1 hora con 1,1 bar de presión y 121 ºC. El sustrato correspondió a 40% de tierra de hoja, 14% de tierra y 46% de arena. Posteriormente, se regó los contenedores y se trasplantó con mucho cuidado la planta proveniente de la condición in vitro, cuidando de no destruir raíces en caso de que éstas estuvieran presentes. 

2.3.6.3 Enraizamiento

Todos estos factores hacen que muchos de los laboratorios que trabajan produciendo plantas in vitro, no realicen el enraizamiento de la microestaquillas in vitro, al resultar problemático, difícil y caro, ya que el proceso de enraizamiento in vitro se estima que implica un costo de entre el 35-75% del coste total de la micropropagación. Por supuesto, no es posible generalizar, ya que la elección del método de enraizamiento va a depender totalmente de la especie y de sus características: porcentajes de enraizamiento y supervivencia final, que varían enormemente de unas especies a otras. Así, cuando el enraizamiento y aclimatación se pueden realizar simultaáneamente, sin que haya demasiada pérdida de plantas, tanto los costes como la eficiencia de la producción se ven muy favorecidas.

2.3.6.2 Crecimiento de yemas adventicias

La formación de raíces adventicias es un fenómeno que ocurre naturalmente en varias especies de plantas. Un ejemplo sencillo son las raíces de “zanco”que se forman en el maíz, así como las numerosas raíces aéreas que se originan en los ficus  como Ficus benjamina y Ficus benghalensis.

La formación de  raíces adventicias en estacas, por ejemplo, es una respuesta a la lesión ocasionada con la preparación de la misma. Durante el corte realizado para la obtención de la estaca se lesiona las células de la superficie cortada quedando expuestos los haces del xilema. Consecuentemente se produce la cicatrización y regeneración en las siguientes fases:

Ø  Al morir las células externa lesionada se realiza un proceso de suberificación y taponamiento del xilema con goma, a fin de evitar la desecación.

Ø  Al cabo de unos días, las células vivas ubicadas debajo de esta placa de corcho empieza a dividirse y se puede formar una capa de células de parénquima conocida como callo.

Ø  La formación de raíces adventicias empieza a ocurrir en ciertas células próximas al cambium vascular y al floema.

2.3.6.1 Formación de callo

Dentro del proceso de formación de raíces adventicias se ha creído que éste es dependiente de la formación previa de una masa irregular conformada por células de parénquima denominada callo. Pero se ha probado que en la mayoría de plantas la formación de callo es independiente de la formación de raíces adventicias y si ocurren simultáneamente es debido a que ambos están condicionados por los mismos factores ambientales que los rodean.

Como en toda regla, para lo expuesto existe una excepción, y está representada por Pinus radiata, Sedum sp. y Hedera hélix, en los cuales la formación de callo es precursora de la formación de raíces adventicias, debido a que estas últimas se originan en el tejido del propio callo.

2.3.5.4 Humedad relativa

Para realizar un trasplante de cultivo a sustrato se llevan a cabo cambios fisiológicos tanto en la adaptación al medio ambiente, pues implica la humedad relativa en este caso es de 70%, esto lleva a la evaporación y transpiración de agua en la planta, función que realizan tanto en la epidermis, parénquima y estomas para la regulación del agua tanto entrada como salida; cuando se presenta calor y aire o viento seco es menos viable la adaptación de la planta al sustrato y principalmente al medio. La fotosíntesis, uno de los procesos más importantes en la planta, tiene que estar estrictamente presente para la adaptación ya sea permanente o temporal de la plántula, pues implica funciones fisiológicas tanto en las raíces, hojas, tallos, yemas y demás partes de esta.

2.3.5.3 Temperatura

Al incubar las yemas axilares provenientes de plantas en campo, en dos temperaturas (5°C y 25°C), se pudo determinar la más adecuada para la conservación in vitro, ya que los resultados muestran un 90% de supervivencia después de 90 días a 5°C, contra un 78% de supervivencia al incubarlas a 25°C. A 5°C, tanto el porcentaje de brotación como la longitud de los brotes, es menor que al incubar las yemas en la temperatura tradicional de cuarto de cultivo (25°C), se presenta un 10% de brotación con brotes de 5 mm de longitud en contra de un 90% de brotación y brotes de hasta 27 mm en 25°C. Los resultados determinan al incubar las yemas a 25°C son diferentes significativamente a los presentados al incubarse a 5°C lo cual indica que la temperatura más baja (5°C) es adecuada para la óptima conservación de yemas axilares, ya que permitió una inhibición en la brotación y no se presentó el desarrollo de éstos.

2.3.5.2 Intensidad lumínica

Así, en los vegetales, la duración y la periodicidad en la iluminación tiene una influencia decisiva sobre la germinación y la duración del crecimiento vegetativo, necesita intensidad de luz para su máximo desarrollo así llegamos a la conclusión de que muchos fenómenos vinculados al desarrollo de las plantas pueden ser activado o no según las horas de luz que reciba.

2.3.5.1 Fotoperiodo

Podemos definir el fotoperiodo como el conjunto de los procesos mediante los cuales muchos organismos y vegetales regulan sus funciones biológicas como puede ser el caso del crecimiento o la reproducción, utilizando como indicador la alternancia día-noche de los diversos días del año, donde encontramos días de larga duración y días de menor duración dependiendo de la estación del año y por lo tanto del ciclo del sol.

Una pequeña observación es que elementalmente las plantas cultivadas in vitro no necesitaran tantas horas de luz; pero el mejor fotoperiodo en vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro. 

2.3.5 Condiciones de incubación

La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura,  calidad e intensidad de luz, fotoperiodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una buena y uniforme circulación de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es  generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo “luz día” con una irradiancia de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad atmosférica debe ser elevada (80-  90%).

2.3.4.3 Siembra de diferentes medios: sólidos y líquidos

Una forma muy útil de poder aislar, identificar y conservar los microorganismos es mediante el uso de medios de cultivo, inicialmente ideados por Pasteur (que como ya sabemos se considera el padre de la microbiología), quien se dio cuenta que los microorganismos podían crecer en soluciones que tuvieran azúcar y una fuente de nitrógeno. De ese tiempo hasta acá, ha pasado mucha agua debajo del puente y actualmente existen medios muy especializados para microorganismos muy exigentes. La forma más sencilla de clasificar los medios de cultivo es por su consistencia…entonces aparecen los medios de cultivo sólidos y los medios de cultivo líquidos o también llamados caldos. En ambos medios debe haber una buena cantidad de nutrientes que faciliten el crecimiento bacteriano… y entonces cual es la diferencia? pues la diferencia radica en la presencia de una sustancia que se llama Agar o “Agar-Agar” y que es la encargada de darle la solidez  y consistencia al medio. Esta sustancia proviene, principalmente, de un alga llamada Gelidium, aunque muchos otros géneros pueden servir como fuente de este polisacárido (es decir, un azúcar grande formado por la unión de azúcares pequeños). Y como se obtiene del alga?…Se toman sus semillas, se lavan, se secan, se realizan procesos de extracción, filtración, purificación y desecación para que queden hojuelas o polvo y luego si adicionarla al medio de cultivo.

Fue, Robert Koch, médico alemán dedicado al estudio de los microorganismos y considerado uno de los autores de la “teoría microbiana”, quien empezó a cultivar y aislar microorganismos. Koch, buscando mejorar la técnica utilizada hasta ese momento, decidió solidificar los medios de cultivo añadiéndoles gelatina. Sin embargo, y a sugerencia de una ayudante, introdujo el agar.

Tiene alguna ventaja el uno sobre el otro?  Pues la ventaja fundamental de usar  un medio de cultivo líquido, es que permite que crezcan bacterias que se encuentran en muy poca cantidad, es decir, cuya concentración es muy baja en la muestra que estemos analizando. Para el caso del medio de cultivo sólido, la ventaja radica en que permite detectar los diferentes tipos de bacterias que puedan encontrarse en una sola muestra..….entonces el usar uno u otro medio de cultivo dependerá de lo que busquemos o queramos: aislar una bacteria que se encuentre en cantidades muy pequeñas (medio líquido) o todas las bacterias que puedan haber en una muestra.

2.3.4.1. Desinfeccion del explante

Proceder a la desinfección superficial de  los explantes mediante el uso de compuestos  químicos con el objeto de eliminar los  microorganismos con el menor daño posible  para el explante. Si bien no es posible recomendar  un procedimiento general, se puede  señalar que el procedimiento más popularizado  consiste en una doble desinfección  mediante la inmersión de los explantes en  etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido  de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido  en el agua de lavandina comercial, durante  3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza  del explante. Algunos procedimientos  se basan en el empleo de únicamente etanol  o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es  necesario eliminar los restos de estos productos  mediante varios lavados con agua destilada  estéril.

2.3.4 Siembra del explante

Época del año. Es un factor que suelen tener mucha importancia en la micropropagación y que generalmente al  grado de dormición que presentan ciertos  explantes (yemas, por ejemplo) y también con la posibilidad de mayor o menor proliferación  de microorganismos.  

2.3.3.3 Tamaño del explante

En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la  regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. También es necesario tener en cuenta que  existe un tamaño mínimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal,  por debajo del cual no es fácil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes  muy pequeños suelen requerir del empleo de medios más complejos o de los denominados  medios acondicionados.

2.3.3.2 Posición del explante en la planta

La influencia de la posición del explante en la planta madre fue demostrada en algunas especies. En Quercus robur L. explantes tomados de las regiones basales y apicales producen la menor frecuencia de formación de vástagos  in vitro  y subsecuente multiplicación (Puddephat  et al., 1997). Sin embargo en  Theobroma cacao L. y  Hevea  brasiliensis Müll. Arg. El crecimiento de los vástagos in vitro mostró un gradiente, incrementándose desde al ápice a la base de la rama madre (Lardet et al., 1998). En Sequoia sempervirens (D. Don) Endl., los vástagos formados in vitro de segmentos basales han sido mejores en términos de crecimiento y en su capacidad rizogénica comparados con los de la copa (Bon et al., 1994). En mandioca las estacas apicales ubicadas por arriba de la primer inflorescencia cultivadas a campo, fueron las que mayor producción de raíces reservantes dieron, además de adelantar las fechas de brotación y floración, como su número (Mogilner et al., 1967).

2.3.3.1 Tipo de explante

Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.

Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece ya en condiciones normales y al cabo de unas semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo.

2.3.3 Explante

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son más bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.

Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996).

2.3.2.5 Edad del órgano o tejido vegetal

La edad de las plantas se expresa de dos formas: la edad ontogenética (juvenilita/madurez) y la edad fisiológica [Olesen, Sivae Genet. 27: 173, (1.978)].

La juvenilidad es definida como la condición de una planta previa a la floración o gametogénesis. Existen una serie de parámetros fenotípicos asociados a la juvenilidad, como cambios en la capacidad de formación de raíces adventicias; en la forma, área, volumen y distribución de estomas; en la longitud de los peciolos; en el volumen del meristemo apical; en la extensión de la actividad meristemática subapical y en el número de nudos por yema; en el hábito de crecimiento y longitud de los internudos; en la respuesta a los reguladores de crecimiento; en la forma del tallo, lignificación, color, producción de espinas. Además, la capacidad organogénica y la resistencia a enfermedades de las plantas juveniles pueden ser diferentes de las propias de plantas adultas [Hackett, Hort. Rev., 7:109, (1.985)].

Aunque varios de estos cambios asociados a la juvenilidad son típicos y observados normalmente en plantas producidas por cultivo de tejidos, estas vitroplantas pueden ser inducidas a florar [Scorza, Hort.Rev., 4:106, (1.982)]. Por lo tanto, las plantas producidas por cultivo de tejidos, no son verdaderamente juveniles salvo si el tejido original era juvenil, en casos extremos la madurez del tejido original se mantiene absolutamente durante el cultivo in vitro y el material de origen juvenil necesita una fase de maduración normal antes de su transición a la fase adulta.

Entre las fases juvenil y adulta existe una fase de transición no muy bien conocida y difícil de delimitar en el tiempo, ya que la maduración es un proceso "a saltos", es decir que se produce como una suma efectos individuales interrelacionados, afectando a lo largo del tiempo a distintos parámetros en diverso grado. Esta fase de transición pues, presenta unas características cualitativas y temporales enormemente variables dependiendo de la especie.

2.3.2.4 Condiciones de crecimiento de la planta

Para obtener buenas condiciones de una planta que a sido extraída de un laboratorio por plantas in vitro debe de mantenerse en buen estado y libre de enfermedades, se tiene que contar con un invernadero para su aclimatación, el cual debe de contar con buena humedad relativa una nutrición adecuada mediante formulas para obtener un optimo desarrollo y buen crecimiento de la planta.

2.3.2.3 Edad de la planta

La vida útil de una planta madre suele ir de entre 10 a 18 meses, aunque en buenas condiciones puedan sobrevivir indefinidamente, es frecuente que las enfermedades radiculares o los hongos acorten su vida a menos de un año. Para prevenirlo y evitarlo podemos añadir al sustrato microorganismos beneficiosos (perlas de bacterias y hongos micorrizas) para que se instalen en la rizófera y refuercen el sistema radicular de nuestras plantas frente al ataque de enfermedades y hongos patógenos. El uso de insecticidas y fungicidas preventivos como el jabón potásico, el aceite de neem o la cola de caballo beneficiarán a nuestras plantas madre y a los clones que cortemos de ellas ayudándonos a evitar plagas o infecciones indeseadas. Utiliza alguno de estos productos al menos una vez por semana o cuando cortes esquejes para que estos estén libres de insectos y enfermedades.

2.3.2.2 Fitosanidad

Las plantas in vitro que se deben utilizar para la propagación deben estar libres de contaminación se deben conservar en un lugar serrado y limpio para obtener plantas sanas en buen estados vegetativos para su propagación, ya que estas son muy sensibles a plagas y enfermedades patógenas.

2.3.2 Selección de plantas madres

2.3.2.1 Genotipo

El Cannabis, al ser una planta, puede reproducirse de manera sexual, por medio de la polinización, y asexualmente, mediante el uso de ciertos órganos de la planta, los tallos, que son capaces de formar nuevas raíces dando lugar a nuevos ejemplares (esquejes o clones) idénticos genéticamente a la planta original.

Así que, se puede decir, que podemos obtener esquejes casi de cualquier planta, aunque una buena planta madre es sólo aquella planta hembra que ha sido criada y seleccionada con la finalidad de poder obtener de ella esquejes o clones idénticos y 100% hembras.

Por ello, sólo se seleccionan como plantas madre alguna ejemplar hembra con rasgos genéticos muy concretos y apreciados, como son un crecimiento rápido, una buena producción, un buen sabor en la fumada, un aroma atractivo, unos efectos potentes o una alta resistencia a ciertas enfermedades y hongos. De esta forma podemos cultivar nuestras plantas favoritas y preservar sus genéticas por tiempo casi indefinido sin que estas pierdan cualidades o se degeneren. Permitiéndonos cultivar una misma genética por un tiempo casi indefinido, ya que el esqueje es una réplica genética exacta de la planta madre. Seleccionar y cultivar plantas madre fuertes y saludables es la clave para mantener una provisión constante de clones hembra de calidad.