2.3 Establecimiento del cultivo de tejidos

2.3.1 Etapas del cultivo de tejidos

Etapa 1.- Elección de una planta madre selecta explantos desinfección superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado. Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos. Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.

Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantos del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo.

Etapa 2.- Transferencia a un  medio de multiplicación Formación de  brotes o embrioides. Los nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.

Etapa 3.- Transferencia a un medio para el enraizamiento de  los brotes.

ENRAIZAMIENTO IN VITRO

 Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar y como la fuente de energía para enraizar está en el medio de cultivo no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.

ENRAIZAMIENTO EX VITRO

Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.
Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.
Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada.

Etapa 4.- Pasaje a maceta en  un invernáculo.

Tanto si los explantos fueron enraizados in vitro como ex vitro, están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantos han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para evitar la desecación del explanto. Por otra parte crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula cérea bien desarrollada.

Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.